自友康正式發(fā)布GMP級間充質干細胞無血清培養(yǎng)基后，很多老師前來咨詢：

你們的原代分離工藝是否有變化??？

我怎么養(yǎng)了好幾天還沒有看見細胞爬出?。?？

我怎樣操作才能分離盡可能多的原代細胞，做出你們展示的數據??？？？

。。。

莫慌！小編在這里帶著大家梳理一下友康體系臍帶MSC的分離及傳代工藝，本工藝適用于新款及老款的無血清培養(yǎng)基。

1. 將醫(yī)用剪刀、組織鑷、手術柄、手術刀等器械提前滅菌。

2. 150mm培養(yǎng)皿或T-175培養(yǎng)瓶。

3. 將5mL培養(yǎng)基因子添加于一瓶500mL培養(yǎng)基中，配制為wan全培養(yǎng)基

1. 用含25mg/L慶大霉素的DPBS清洗臍帶3遍，后用不含慶大霉素的DPBS清洗臍帶至清洗液無血色。

2. 使用醫(yī)用剪刀將臍帶處理成2cm大小的組織段，每段組織沿臍帶靜脈將臍帶剪開。

3. 使用組織鑷撕去臍帶靜脈內膜、外皮、兩根動脈使華通氏膠充分暴露。

4. 使用手術刀將華通氏膠剪切成邊長 3-5mm 的小塊，每2cm組織段切成的華通氏膠小塊接種于一個150mm培養(yǎng)皿中使組織塊均勻分布，添加10mL-15mLwan全培養(yǎng)基。

特別提示：此處組織塊的大小極為關鍵，組織塊過小不易貼壁，細胞難以爬出；組織塊過大細胞爬出時間將延后，3-5mm邊長是友康測試最為合適的大小。

5. 24-48h 后，補充wan全培養(yǎng)基至30mL。

6. 7天全量換液。

7. 10天全量換液。

8. 12-14天收獲原代細胞。

使用其它表面積培養(yǎng)皿接種量如下：

1. 培養(yǎng)72h后，在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的MSC細胞，當細胞融合度達到 90%，即可傳代。

特別提示：

細胞融合度請勿超過100%，特別是切勿使局部過密，導致疊層生長，甚至聚集成球，會導致細胞嚴重衰老及分化。再者傳代前細胞生長過密（細胞融合度過高），導致細胞消化異常（細胞整片或成片脫落），加之隨后的不當操作（用移液器反復吹打成片細胞使其成為單個細胞），此操作所導致的機械損傷會嚴重損害細胞膜，引發(fā)大比例的細胞死亡，特別是這些細胞經凍存后再次使用時。

2. 在超凈臺中，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入10 mL PBS清洗細胞后棄去。

3. 加入3 mL 干細胞溫和消化酶常溫下消化細胞。

4. 在顯微鏡下觀察到細胞全部收縮變圓，且有少量細胞開始流動時（一般2-5分鐘），立即加入溫和酶使用量2倍體積（6mL）的細胞培養(yǎng)上清或者wan全培養(yǎng)基稀釋細胞懸液。

特別提示：

使用培養(yǎng)上清液或wan全培養(yǎng)基稀釋溫和消化酶（貨號：NC1004.1）對細胞有較好的保護作用，比使用DPBS等緩沖液會多

回收10～30%的細胞，而且培養(yǎng)上清液或wan全培養(yǎng)基能夠更好的保持細胞活性，能一直維持較高的擴增倍數。

5. 用移液器輕輕吹打瓶壁上未wan全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞wan全分散。

特別提示：

進行該操作時動作一定要溫和，因為細胞消化過程中的細胞損傷，更多的是來自于類似吹打與離心的機械損傷。

6. 將細胞懸液轉移到15 mL 離心管中，300g離心5 min。棄上清，加入2mLwan全培養(yǎng)基重懸細胞，使用臺盼藍染色，或流式細胞儀等方法計數。

7. T175瓶加入35mLwan全培養(yǎng)基。按密度8000 cells/cm2 接種細胞。

特別提示：

應讓培養(yǎng)基沿培養(yǎng)瓶的上表面（細胞生長面的相對面）或側表面加入，切忌沖到培養(yǎng)瓶底面，否則容易在培養(yǎng)基沖刷到培養(yǎng)瓶底面位置出現細胞生長空白區(qū)域。

離心步驟不可去除，干細胞溫和消化酶短時間內對細胞無損傷，但切勿超過10分鐘。

8. 將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。